Beberapa hari setelah pengobatan akibat pertarungan Sasuke melawan Deidara, Sasuke bergegas untuk menyelesaikan misinya. Di perjalanan, ia bertemu dengan Itachi yang ternyata hanyalah sebuah bunshin yang dibuat oleh Itachi. Bunshin yang dibuat oleh Itachi itu mengatakan Sasuke untuk bertarung dengannya di ruang rahasia klan Uciha.
Setelah mendengar perkataan Itachi, Tim Hebi pun bergerak menuju lokasi pertarungan yang telah ditentukan. Di sana mereka dihadang oleh Hoshigaki Kisame yang hanya mengizinkan Sasuke untuk melewatinya. Bertemu kembali dengan Itachi,mereka berdua bertarung.
Pada pertarungan pertama, mereka berdua saling menggunakan teknik genjutsu. Itachi yang menggunakan Genjutsu Tsukuyomi tidak mampu melawan tekad Sasuke sehingga teknik genjutsu terhebat miliknya dapat dipatahkan oleh genjutsu Sasuke. Karena itulah, Itachi memulai serangan kedua dengan menggunakan shurikennya. Begitupun dengan Sasuke. Mereka saling mengadu teknik shuriken mereka dan karena penglihatan Itachi yang mulai kabur akibat terlalu sering menggunakan Mangekyou Sharingan, maka pertarungan kedua itupun dimenangkan oleh Sasuke.
Melihat perkembangan Sasuke yang meningkat pesat, Itachipun menggunakan teknik terkuatnya, Amaterasu. Teknik ninjutsu Itachi ini akan membakar apapun yang ada di hadapannya dalam bentuk kobaran api hitam. Sasuke yang mulai kehabisan chakrapun menggunakan jurus terakhir dan terkuatnya yakni kilat yang menyambar dari langit dalam bentuk naga yang disebut kirin.
Jurus terakhir yang dikeluarkan Sasuke mengakibatkan hancurnya bangunan ruang rahasia klan Uchiha. Namun Itachi sempat menahan serangan yang kuat dan cepat milik Sasuke itu dengan menggunakan teknik andalannya yakni Susano'O. Karena kehabisan chakra, Orochimaru yang dihisap oleh Sasuke berhasil keluar dari tubuh Sasuke dalam bentuk Hidra karena tidak adanya chakra Sasuke yang menekannya. Orochimarupun menyerang Itachi (bersama Susano'O nya) namun usaha Orochimaru gagal karena kemampuan Itachi lebih unggul di atasnya. Dengan menggunakan pedang Totsuga yang disembunyikan dalam Susano'O, Itachi memusnahkan Orochimaru selama-lamanya dari tubuh Sasuke.
Dengan sisa - sisa tenaganya, Itachi mendekati Sasuke untuk mengambil bola matanya. Sasuke menyerang namun semua usahanya sia-sia mengingat Susano'O masih melindungi Itachi. Setelah mendekati Sasuke, Itachi menyentuh dahi Sasuke kemudian jatuh tersungkur dan meninggal karena kehabisan chakra dan luka yang diderita akibat menggunakan semua jurus Mangekyou Sharingan. Hujan pun turun dan Sasuke juga pingsan karena kehabisan chakra. Mereka berdua dibawa oleh Tobi dan Zetsu yang mengawasi gerakan mereka berdua selama pertarungan berlangsung. Di markas Akatsuki, Tobi (alias Madara Uchiha) menceritakan kebenaran tentang klan Uchiha dan Itachi.
Madara memberitahu Sasuke bahwa sebenarnya Itachi membunuh klan Uchiha atas perintah Hokage ketiga, Danzo dan Go Ikenban (Homura Mitokado dan Koharu Utatane), dan tidak membunuh Sasuke karena menganggap nyawa Sasuke jauh lebih berharga daripada desa Konoha. Pertarungan Sasuke vs Itachi juga ternyata direncanakan Itachi untuk menyegel Orochimaru selamanya dan membangkitkan Magekyo Sharingan Sasuke. Madara menyatakan bahwa Itachi berpikir ia harus bertarung dengan Sasuke dan meninggal di hadapannya.
